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詳細解讀美國伯樂熒光定量PCR的工作原理
點擊次數(shù)：2689 更新時間：2021-12-09
 
　　美國伯樂熒光定量PCR(Real-timePCR)，是指在PCR擴增反應體系中加入熒光基團，通過對擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
 
　　美國伯樂熒光定量PCR工作原理：
 
　　以探針法熒光定量PCR為例：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時，探針完整地結合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，Taq酶將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
 
　　傳統(tǒng)的PCR進行檢測時，擴增反應后需要進行染色處理及電泳分離，并且只能作定性分析，不能準確定量，易造成污染出現(xiàn)假陽性，使其應用受到限制。實時定量PCR技術不僅實現(xiàn)了對模板的定量，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動化程度高和無污染的特點，使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。
 
　　在PCR擴增反應的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線，這條線是可以自動生成也可以手動設置的。之后反應會進入指數(shù)增長期，這個期間擴增曲線具有高度重復性，在該期間，可設定一條熒光閾值線，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般會將熒光閾值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值，這個值與起始濃度的對數(shù)成線性關系，且該值具有重現(xiàn)性。